La contaminazione degli acidi nucleici è da tempo un ostacolo significativo al progresso delle tecnologie diagnostiche molecolari. Con lo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili, è cresciuta la domanda di una maggiore purezza di enzimi e proteine. Una delle sfide principali nella produzione di proteine è la rimozione efficace della contaminazione degli acidi nucleici. La presenza di acidi nucleici può compromettere la funzione e l'attività delle proteine, portando potenzialmente a problemi come legame non specifico, inibizione dell'attività enzimatica o aumento dei segnali di fondo, che in ultima analisi influenzano l'accuratezza dei risultati diagnostici.
Di conseguenza, lo sviluppo di processi efficienti per la rimozione degli acidi nucleici durante la produzione proteica è fondamentale ed essenziale.
Dopo anni di ricerca tecnologica, Yeasen Biotechnology ha sviluppato un metodo integrato chiuso per una rimozione efficiente degli acidi nucleici. Questo processo ottimizza la permeabilizzazione cellulare, incorpora la purificazione della colonna a scambio anionico-cationico, le fasi di microfiltrazione e ultrafiltrazione e include il monitoraggio completo del processo dei residui. Questo approccio integrato garantisce la massima rimozione della contaminazione degli acidi nucleici, consentendo la purificazione degli enzimi molecolari con residui di DNA ultra-bassi.
Strategie complete per prevenire la contaminazione del DNA nella produzione di proteine
La contaminazione del DNA è una sfida pervasiva nella produzione di prodotti biologici, che ha un impatto significativo sulla loro purezza, qualità e accuratezza dei risultati sperimentali. La presenza di DNA nelle preparazioni proteiche può portare a conclusioni sperimentali imprecise, distorcere i dati e aumentare potenzialmente la probabilità di falsi positivi. Per ricercatori e produttori coinvolti nella produzione di proteine, è essenziale implementare strategie efficaci per prevenire e mitigare la contaminazione del DNA. Questo articolo esplora come evitare la contaminazione del DNA, in particolare la contaminazione aerea, e delinea metodi per rimuovere efficacemente il DNA dai campioni di proteine.
IO. Prevenire la contaminazione del DNA nell'aria
La contaminazione del DNA nell'aria rimane una preoccupazione critica nella produzione di proteine, in particolare in ambienti in cui il controllo microbico e particolato è essenziale. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione del DNA nell'aria, dovrebbero essere impiegate le seguenti strategie:
| 1. Creare un ambiente di camera bianca Condurre la produzione di proteine in una camera bianca fornisce l'ambiente controllato necessario per ridurre al minimo le particelle e i microbi trasportati dall'aria che potrebbero introdurre la contaminazione del DNA. Le camere bianche devono soddisfare specifici standard di pulizia per garantire un'atmosfera priva di contaminanti. | 2. Implementare sistemi di filtrazione HEPA I sistemi di purificazione dell'aria dotati di filtri HEPA sono essenziali per intrappolare le particelle sospese nell'aria, tra cui polvere, contaminanti microbici e frammenti di DNA. Questi filtri aiutano a mantenere l'aria pulita in tutto l'impianto di produzione. |
| 3. Mantenere un ambiente a pressione positiva Gli ambienti a pressione positiva impediscono l'ingresso di aria contaminata dall'esterno dello spazio controllato. Mantenere una pressione dell'aria più elevata all'interno dell'area di produzione rispetto agli ambienti esterni garantisce che eventuali perdite portino alla fuoriuscita di aria, non alla sua intrusione. | 4. Protocolli di pulizia e disinfezione di routine La pulizia regolare dell'area di produzione con disinfettanti appropriati, come nucleasi o detergenti a base di cloro, può degradare il DNA presente nell'aria, riducendo il rischio di contaminazione. Ciò è particolarmente importante nelle aree ad alto contatto e sulle superfici in prossimità delle apparecchiature di produzione delle proteine. |
| 5. Limitare il movimento del personale Ridurre al minimo lo spostamento del personale all'interno degli ambienti delle camere bianche riduce il potenziale di introduzione di contaminanti tramite interazione umana. Il personale designato deve seguire rigidi protocolli riguardanti l'ingresso e l'uscita per controllare l'esposizione. | 6. Monitoraggio della qualità dell'aria Il monitoraggio della qualità dell'aria all'interno della camera bianca, inclusi i conteggi microbici e i livelli di particolato, è essenziale per garantire la conformità continua con gli standard di produzione. I campionatori d'aria e i contatori di particelle possono essere impiegati per valutare la pulizia dell'ambiente. |
| 7. Adottare materiali monouso L'utilizzo di materiali di consumo monouso per la produzione di proteine riduce significativamente il rischio di contaminazione incrociata, frequente con le attrezzature riutilizzabili. | 8. Processi di produzione chiusi I sistemi chiusi, come i bioreattori o le camere sigillate, riducono al minimo l'esposizione all'ambiente aperto. Ciò riduce il rischio di contaminazione del DNA dall'aria, in particolare durante fasi critiche come la fermentazione e la purificazione delle proteine. |
| 9. Evitare la generazione di aerosol La formazione di aerosol durante la produzione di proteine può facilitare la diffusione del DNA nell'aria. Misure precauzionali, come la manipolazione attenta e il trasferimento di liquidi senza agitazione, possono ridurre al minimo la formazione di aerosol. | 10. Utilizzo delle nucleasi Trattare superfici e attrezzature con nucleasi prima e dopo l'uso può degradare il DNA residuo che potrebbe essere rimasto dopo processi come la lisi cellulare o la filtrazione. |
| 11. Implementare l'isolamento ambientale Per operazioni ad alto rischio come la purificazione e la formulazione delle proteine, l'uso di isolatori o glove box offre un ulteriore livello di protezione, isolando il processo dai contaminanti presenti nell'aria. | 12. Attrezzature e strumenti dedicati L'utilizzo di attrezzature dedicate, impiegate esclusivamente per la produzione di proteine, impedisce la contaminazione incrociata da strumenti e utensili che potrebbero essere stati esposti al DNA o agli acidi nucleici in altri processi. |
| 13. Piano di risposta alle emergenze in caso di contaminazione Dovrebbe essere in atto un piano di risposta efficace per gestire la contaminazione accidentale del DNA. Il protocollo dovrebbe includere misure rapide di identificazione, contenimento e bonifica per prevenire la diffusione e ridurre al minimo l'impatto della contaminazione. | 14. Formazione dei dipendenti La formazione continua del personale sui rischi di contaminazione del DNA e sull'importanza di tecniche di manipolazione adeguate garantisce l'implementazione delle migliori pratiche e il rispetto dei protocolli di controllo della contaminazione. |
II. Rimozione della contaminazione del DNA dalle proteine
Durante la purificazione delle proteine, rimuovere qualsiasi contaminazione residua di DNA è fondamentale per mantenere la qualità delle proteine. Sono comunemente utilizzate diverse tecniche per eliminare il DNA dai campioni di proteine:
| 1. Metodi di lisi cellulare blanda I buffer di lisi non distruttivi consentono il rilascio di proteine riducendo al minimo la rottura del DNA. Questo approccio evita la distruzione indiscriminata del DNA, riducendo la probabilità di contaminazione del campione proteico. | 2. Condizioni di lisi ottimizzate La regolazione di fattori come il pH e la forza ionica durante la lisi cellulare può impedire la solubilizzazione del DNA, riducendo così la quantità di DNA contaminante nel campione risultante. |
| 3. Inibizione della nucleasi L'uso di inibitori della proteasi, come il fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF), può impedire l'attività delle nucleasi all'interno delle cellule, consentendo una degradazione del DNA più controllata e selettiva durante la lisi. | 4. Shock osmotico Lo shock osmotico è un metodo delicato per lisare le cellule, inserendole in una soluzione con una differenza improvvisa nella pressione osmotica. Ciò può aiutare a ridurre il rilascio di DNA, portando a preparazioni proteiche più pulite. |
| 5. Lisi enzimatica L'uso di enzimi come il lisozima per degradare le pareti cellulari batteriche è un metodo controllato di lisi che colpisce solo la membrana cellulare, riducendo il rischio di contaminazione del DNA durante il rilascio del contenuto cellulare. | 6. Trattamento post-lisi Una volta lisate le cellule, il raffreddamento immediato del campione può aiutare a ridurre l'attività della nucleasi, che altrimenti porterebbe a un'ulteriore degradazione del DNA nella soluzione. |
PARTE III Metodi avanzati per la rimozione degli acidi nucleici
L'utilizzo della cromatografia o di metodi basati sull'affinità nell'elaborazione a valle può ulteriormente rimuovere tracce di contaminanti del DNA dalle preparazioni proteiche. La cromatografia a scambio anionico e a scambio cationico sono due tecniche consolidate per rimuovere la contaminazione del DNA dai campioni di proteine. Entrambe si basano sull'interazione tra acidi nucleici e superfici cariche per rimuovere selettivamente il DNA.
| 1. Colonne di scambio anionico Le colonne a scambio anionico utilizzano fasi stazionarie caricate positivamente per attrarre e legare acidi nucleici caricati negativamente. Regolando la concentrazione salina del tampone di eluizione, gli acidi nucleici possono essere rimossi selettivamente dalla preparazione proteica. | 2. Colonne di scambio cationico In condizioni specifiche, le colonne a scambio cationico possono anche essere utilizzate per rimuovere gli acidi nucleici. Aumentando la concentrazione di sale o modificando il pH, gli acidi nucleici possono essere eluiti in modo competitivo dalla colonna. |
| 3. Ultrafiltrazione L'ultrafiltrazione utilizza la filtrazione selettiva a membrana per separare le proteine dagli acidi nucleici, garantendo che il DNA venga rimosso in modo efficace durante le fasi di purificazione. | 4. Cromatografia a filtrazione su gel La filtrazione su gel è una tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale che separa le molecole in base alle loro dimensioni. Gli acidi nucleici, essendo più grandi delle proteine, vengono separati in modo efficace, lasciando campioni di proteine pure. |
IV. Riduzione della contaminazione del DNA da parte del personale
Il personale svolge un ruolo significativo nella potenziale introduzione di contaminazione del DNA nei processi di produzione delle proteine. Le seguenti misure possono aiutare a mitigare questo rischio:
| 1. Formazione completa del personale Tutto il personale dovrebbe ricevere una formazione sull'importanza del controllo della contaminazione del DNA e sulle migliori pratiche per prevenirla. | 2. Dispositivi di protezione individuale (DPI) Il personale deve indossare DPI adeguati, come camici, guanti, maschere e occhiali protettivi, per ridurre al minimo il rischio di contaminazione del DNA dovuta al contatto umano. |
| 3. Protocolli per l'igiene delle mani Lavarsi spesso le mani e utilizzare disinfettanti a base di alcol sono essenziali per ridurre il trasferimento del DNA dalle mani alle superfici e alle attrezzature. | 4. Cambiamenti di abbigliamento e calzature Indossare abiti e calzature da lavoro specifici garantisce che la contaminazione del DNA non venga introdotta dall'esterno dell'area di produzione. |
| 5. Norme severe sul comportamento sul lavoro Il personale deve astenersi dal mangiare, bere o parlare nell'area di produzione delle proteine per evitare l'introduzione di DNA tramite saliva, particelle di cibo o goccioline. | 6. Monitoraggio ambientale È necessario effettuare un monitoraggio ambientale regolare, compresi controlli dell'aria, delle superfici e delle attrezzature, per garantire che nell'area di produzione non sia presente contaminazione da DNA. |
Conclusione
Per garantire la produzione di proteine di alta qualità e non contaminate, è necessario un approccio completo al controllo della contaminazione del DNA.Adottando rigorosi controlli ambientali, impiegando metodi di purificazione ottimizzati e sottolineando la formazione del personale, i rischi associati alla contaminazione del DNA possono essere notevolmente ridotti. Queste pratiche sono fondamentali per mantenere l'integrità e l'affidabilità dei prodotti proteici nella ricerca e nelle applicazioni industriali, contribuendo in ultima analisi al progresso dello sviluppo di prodotti biologici.
Prodotti correlati
1. UCF.ME Uracil DNA glicosilasi (UDG/UNG), termolabile
2. Inibitore RNasi murino UCF.ME
Vantaggi del prodotto
- Residuo ultra-basso di UCF.ME—residuo di DNA genomico di E. coli <0,1 copie/U;
- Basso residuo di nucleasi: nessuna esonucleasi residua, enzima di nicking o RNasi;
- Elevata capacità di digestione: 0,05 U/T possono digerire 105 copie/T di prodotti dU-DNA;
- Buona termolabilità: inattivazione completa in qualsiasi condizione di 50°C per 10 minuti, 55°C per 5 minuti o 95°C per 5 minuti;
- Compatibile con i sistemi di reazione RT-qPCR: nessun impatto sul sistema di rilevamento anche a livelli di input elevati (sistema di reazione 2U/20μL).
（1）Nucleasi a basso residuo: nessuna esonucleasi residua, enzimi di nicking o RNasi
Figura 1. Risultati del test sui residui di nucleasi
（2）Residuo di DNA genomico di E. coli < 0,1 copie/U
Figura 2. Risultati del test sui residui del DNA genomico di E. coli
Informazioni per l'ordinazione
| Gatto: | Nome | Applicazione |
| Hieff UNICON UCF. ME™ Advanced Hotstart Taq DNA Polimerasi | PCR | |
| 14608 | Trascrittasi inversa Hifair UCF.ME™ V (200 U/μL) | RT-PCR |
| UCF.ME™ Uracil DNA glicosilasi (UDG/UNG), termolabile, 1 U/μL | RT-PCR | |
| Università della Florida.Inibitore della RNasi murina ME™ (40 U/µL) | RT-PCR | |
| Kit sonda Hifair™ V2 Multiplex One Step RT-qPCR (UDG Plus, GC enhancer plus) | RT-PCR | |
| Hieff Unicon® Pure Pro U+ qPCR Mix (una provetta) | PCR-q | |
| Kit di sintesi ds-cDNA Hieff NGS™ | mNGS | |
| 13501 | Kit di sintesi ds-cDNA Hieff NGS™ (digestore gDNA più) | mNGS |
| Kit di preparazione della libreria DNA Flash OnePot Hieff NGS™ | mNGS | |
| 13490 | Kit di preparazione della libreria DNA Hieff NGS™ OnePot II per Illumina | mNGS |
| 12946 | Kit di sintesi del primo cDNA Hieff NGS™ 10x | tNGS per patogeno |
| Kit RT-PCR multiplex Hieff™ 4x | tNGS per patogeno | |
| 4x Hieff™ Multiplex PCR Master Mix | NGS per patogeno | |
| 12977 | 4x Hieff™ Multiplex PCR Master Mix 2.0 | NGS per patogeno |
| Kit di rilevamento dei residui di DNA delle cellule ospiti di E. coli (2G) | Controllo di qualità | |
| Kit di preparazione del campione di DNA residuo magnetico MolPure™ | Controllo di qualità |