Mycoplasma, còn được gọi là sinh vật giống viêm phổi màng phổi (PPLO), là sinh vật nhân sơ nhỏ nhất và đơn giản nhất được phát hiện cho đến nay không có thành tế bào. Chúng có đường kính từ 0,1 đến 0,3 μm, có thể đi qua bộ lọc và biểu hiện tính đa hình cao. Chúng tương đối phổ biến và khó phát hiện chất gây ô nhiễm vi khuẩn trong nuôi cấy tế bào động vật có vú
Nhiễm Mycoplasma có nhiều tác động tiêu cực đến nuôi cấy tế bào và đã trở thành vấn đề nghiêm trọng trong thực hành nuôi cấy tế bào. Người ta ước tính thận trọng rằng tỷ lệ nhiễm Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào thông thường dao động từ 15% đến 35%, điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến độ tin cậy của kết quả thực nghiệm.
Khoảng 95% sự nhiễm mycoplasma trong nuôi cấy tế bào chủ yếu là do Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis và Mycoplasma hyorhinis. Trên môi trường nuôi cấy, các khuẩn lạc mycoplasma tạo thành hình dạng 'trứng rán'. Dịch nuôi cấy tế bào và màng tế bào cung cấp môi trường thích hợp cho sự phát triển của mycoplasma, và mycoplasma ký sinh trên bề mặt tế bào có thể xâm nhập vào màng tế bào vật chủ.
Các nguồn chính gây nhiễm mycoplasma bao gồm: môi trường nuôi cấy tế bào hoặc các thành phần của môi trường (như nguyên liệu thô cho môi trường, huyết thanh và các thuốc thử khác), nhân viên phòng thí nghiệm, tủ ấm nuôi cấy tế bào, bể chứa nitơ lỏng, các hạt và khí dung trong không khí, lạm dụng kháng sinh, nuôi cấy tế bào không được đậy kín đúng cách và các tế bào đã bị nhiễm mycoplasma.
Trong khi đó, các mối nguy hiểm tương ứng của những sự nhiễm bẩn này bao gồm: dẫn đến việc loại bỏ hàng loạt các sản phẩm tế bào hoặc các sản phẩm được sản xuất bằng cách sử dụng tế bào làm môi trường do không có khả năng loại bỏ hiệu quả mycoplasma trong quá trình tinh chế hạ lưu; làm nhiễm bẩn tất cả các thiết bị và cơ sở liên quan, cũng như các sản phẩm trung gian hoặc cuối cùng, tiếp xúc với vật liệu bị nhiễm bẩn; khiến các tế bào bình thường khác bị nhiễm mycoplasma; dẫn đến việc loại bỏ các ngân hàng hạt giống tế bào hoặc vi-rút quan trọng do nhiễm mycoplasma; buộc phòng thí nghiệm phải dừng sản xuất hoặc các hoạt động thử nghiệm để giải quyết tình trạng nhiễm mycoplasma; dẫn đến sự phát triển của khả năng kháng mycoplasma, khiến việc loại bỏ nó thậm chí còn khó khăn hơn; mở rộng diện tích nhiễm mycoplasma; và gây ra mối đe dọa đối với các nuôi cấy tế bào khác trong phòng thí nghiệm.
Do đó, cần phải tiến hành xét nghiệm và loại bỏ mycoplasma thường xuyên để đảm bảo không còn mycoplasma trong hệ thống nuôi cấy tế bào, điều này rất cần thiết cho sự tiến triển bình thường của nghiên cứu khoa học.
Mycoplasma Phát hiện
Mycoplasma là một loại ô nhiễm tương đối phổ biến nhưng thường khó loại bỏ. Đối với các quy trình sinh học liên quan đến nuôi cấy tế bào, các quy định yêu cầu rằng 'không được có ô nhiễm mycoplasma'.
- Ấn bản năm 2020 của Dược điển Trung Quốc, Tập III, 'Chuẩn bị và kiểm soát chất lượng chất nền tế bào động vật để sản xuất và thử nghiệm các sản phẩm sinh học' quy định rằng đối với các tế bào được sử dụng trong sản xuất, thử nghiệm mycoplasma phải được tiến hành trên Ngân hàng tế bào chính (MCB), Ngân hàng tế bào đang hoạt động (WCB) và Tế bào cuối sản xuất (EOPC).
- FDA, Hướng dẫn cho ngành công nghiệp: Đặc tính và đánh giá chất nền tế bào và các vật liệu sinh học khác được sử dụng trong sản xuất vắc-xin vi-rút để điều trị bệnh truyền nhiễm, quy định rằng việc kiểm soát mycoplasma phải được thực hiện trên nguyên liệu thô, hạt giống vi-rút, dịch thu hoạch chưa qua chế biến và các vật liệu tương tự khác.
- ICH Q5D, 'Nguồn gốc và đặc tính của chất nền tế bào được sử dụng để sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học/sinh học', cũng đề cập rằng việc kiểm soát mycoplasma phải được thực hiện trên nguyên liệu thô, hạt giống vi-rút, dịch thu hoạch chưa qua chế biến và các vật liệu tương tự khác.
Hình 1 Các điểm xét nghiệm nhiễm Mycoplasma theo quy định trong nước và quốc tế
Các phương pháp phát hiện mycoplasma truyền thống chủ yếu bao gồm các phương pháp nuôi cấy và phương pháp tế bào chỉ thị. Tuy nhiên, do chu kỳ phát hiện dài hoặc các vấn đề về độ nhạy của hai phương pháp này, chúng dẫn đến chu kỳ sản xuất hoặc phát hành sản phẩm kéo dài cho các doanh nghiệp. Với sự phát triển của liệu pháp tế bào và gen, các yêu cầu của ngành về tính kịp thời và độ nhạy của việc phát hiện mycoplasma ngày càng trở nên nghiêm ngặt hơn. Thời hạn sử dụng ngắn không đủ để hỗ trợ các giai đoạn phát hiện dài như vậy, đó là lý do tại sao phương pháp NAT (Xét nghiệm axit nucleic) nhanh chóng nổi bật trong số các phương pháp phát hiện mycoplasma khác nhau.
Hình 2 Các phương pháp phát hiện Mycoplasma được liệt kê trong các quy định trong nước và quốc tế
Dựa trên NAT (kỹ thuật khuếch đại axit nucleic),
Đây là sản phẩm dùng để phát hiện nhanh định tính khả năng nhiễm mycoplasma trong nguyên liệu sản xuất, ngân hàng tế bào, hạt virus, dịch thu hoạch virus hoặc tế bào và tế bào điều trị. Sản phẩm chủ yếu được sử dụng trong quá trình nghiên cứu, phát triển, sản xuất và phát hành dược phẩm sinh học.
Tiêu chuẩn sản phẩm
Tuân thủ quy định: Được xác nhận theo yêu cầu của dược điển EP2.6.7, JP G3 và USP 63, đáp ứng các tiêu chuẩn của các tổ chức có thẩm quyền quốc tế.
Tuân thủ kiểm toán: Quá trình sản xuất sản phẩm tuân thủ theo tiêu chuẩn hệ thống quản lý chất lượng ISO13485 và được hỗ trợ bởi tài liệu kiểm toán toàn diện.
Đảm bảo chất lượng: Tất cả các nguyên liệu enzyme cần thiết cho bộ dụng cụ đều được tự sản xuất và đã được công nghiệp hóa, đảm bảo nguồn cung ổn định.
Tích lũy kinh nghiệm kỹ thuật: Phương pháp TaqMan có nền tảng kỹ thuật vững chắc và độ nhạy của bộ dụng cụ có thể đạt tới 10 CFU/mL trở xuống.
Tập trung vào hiệu suất sản phẩm: Thư viện kháng thể enzym Taq, với kháng thể chặn kép, giúp tăng cường độ đặc hiệu, độ nhạy và độ ổn định của bộ dụng cụ.
Tính năng sản phẩm
Nhiều loại phát hiện: Các đầu dò TaqMan được tối ưu hóa có thể phát hiện tới 183 loài mycoplasma.
Dễ sử dụng: Tổng thời gian chuẩn bị và thử nghiệm mẫu là chưa đầy 3 giờ, loại bỏ nhu cầu phải chờ đợi 28 ngày như phương pháp nuôi cấy.
Độ nhạy cao: Giới hạn phát hiện thấp tới 10 CFU/mL, khiến đây trở thành phương pháp thay thế khả thi cho phương pháp nuôi cấy trực tiếp.
Độ đặc hiệu cao: Các mồi và đầu dò được thiết kế nhắm vào 16S rRNA, đảm bảo không có phản ứng chéo với các loài có quan hệ gần như clostridia và lactobacilli.
Độ an toàn cao: Đối chứng dương tính (PC) trong bộ dụng cụ không gây nhiễm trùng, loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm bẩn.
Khả năng chống nhiễu mạnh: Việc đưa vào kiểm soát nội bộ (IC) giúp loại trừ sự can thiệp của mẫu và những bất thường trong quá trình chuẩn bị phản ứng, giúp tránh được kết quả âm tính giả.
Hình 3 Quy trình làm việc để phát hiện Mycoplasma bằng bộ dụng cụ phát hiện Mycoplasma Real-time qPCR
2. Bộ phát hiện Mycoplasma một bước MycAway™ Plus-ColorNó sử dụng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt độc đáo, cung cấp khả năng phân biệt màu sắc cao hơn. Sự thay đổi từ màu xanh tím (âm tính) sang màu xanh da trời (dương tính) dễ dàng nhận biết hơn bằng mắt thường. Ngoài ra, nó bao gồm các thành phần chống nhiễm bẩn để loại bỏ hiện tượng dương tính giả.
Hình 4: Quy trình vận hành để phát hiện Mycoplasma bằng bộ dụng cụ phát hiện Mycoplasma một bước MycAway™ Plus-Color
3.GMyc-PCR Mycoplasma Phát hiệnBộ dụng cụKhông giống như các phương pháp phát hiện PCR một bước thông thường, số lượng mồi được tăng từ một cặp lên ba cặp, nhắm vào các vùng bảo tồn của mycoplasma 16S và 23S rRNA để khuếch đại PCR lồng nhau. Điều này không chỉ làm giảm các sản phẩm không đặc hiệu mà còn tăng cường đáng kể độ nhạy của sản phẩm, cho phép phát hiện ít nhất một bản sao của mycoplasma.
、
Hình 5 Quy trình vận hành để phát hiện Mycoplasma bằng bộ xét nghiệm Mycoplasma GMyc-PCR
Loại bỏ Mycoplasma
Trong quá trình nuôi cấy tế bào, việc kiểm tra thường xuyên có thể ngăn ngừa hiệu quả tình trạng nhiễm mycoplasma trên diện rộng. Tuy nhiên, nếu các tế bào đã bị nhiễm mycoplasma, chúng cần được xử lý kịp thời. Phương pháp tốt nhất là khử trùng các tế bào bị nhiễm dưới áp suất cao rồi loại bỏ chúng để tránh làm nhiễm các dòng tế bào sạch khác. Nếu các tế bào bị nhiễm đặc biệt có giá trị và cần loại bỏ tình trạng nhiễm mycoplasma, có thể sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh để đạt được mục tiêu này. Vì mycoplasma không có thành tế bào nên các loại kháng sinh thông thường thường không có hiệu quả đối với chúng. Do đó, việc lựa chọn thuốc thử loại bỏ mycoplasma phù hợp là rất quan trọng.
Tính năng sản phẩm
Độc tính thấp: Ít độc tính đối với tế bào, đảm bảo không gây trở ngại cho các thí nghiệm tế bào tiếp theo như xét nghiệm chuyển gen và khả năng sống.
Độ ổn định cao: Thuốc thử có thể được bảo quản trong thời gian dài ở nhiệt độ -20°C và vẫn duy trì được hiệu quả cao.
Dễ sử dụng: Chỉ cần thêm sản phẩm vào môi trường nuôi cấy bị nhiễm mycoplasma và ủ.
Tác dụng nhanh: 'Kết quả tức thì', hiệu quả có thể thấy rõ chỉ trong vòng 3 ngày.
Phổ rộng: Có khả năng loại bỏ phần lớn các loại mycoplasma có trong phòng thí nghiệm.
Hình 6.Minh họa về thử nghiệm độc tính của thuốc thử loại bỏ Mycoplasma
Phòng ngừa Mycoplasma
Trong quá trình nuôi cấy tế bào, thường xảy ra hiện tượng nhiễm mycoplasma. Tuy nhiên, do đặc điểm riêng biệt nên rất khó phát hiện bằng mắt thường hoặc thiết bị hiển vi. Do đó, việc phòng ngừa mycoplasma là đặc biệt quan trọng. Có thể phòng ngừa hiệu quả tình trạng nhiễm mycoplasma bằng cách thêm thuốc thử phòng ngừa mycoplasma vào môi trường nuôi cấy.
Hiện nay, mycoplasma trong phòng thí nghiệm chủ yếu bắt nguồn từ: sự lây nhiễm chéo giữa các tế bào, sự lây nhiễm của môi trường làm việc hoặc thiết bị phòng thí nghiệm, kỹ thuật vô trùng kém của người thử nghiệm, môi trường nuôi cấy hoặc thuốc thử bị nhiễm bẩn và các mô hoặc cơ quan ban đầu bị nhiễm mycoplasma. Dòng sản phẩm phòng ngừa mycoplasma do
Thông tin sản phẩm
| Sản phẩm | Số danh mục | Tên sản phẩm | thông số kỹ thuật sản phẩm |
| Bộ dụng cụ xử lý mẫu | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | Bộ chuẩn bị mẫu MolPure® Mag48 FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Thiết bị chiết xuất axit nucleic | 80511ES | Máy chiết xuất axit nucleic tự động 48 kênh | 48 kênh |
|
Bộ phát hiện Mycoplasma | 40619ES | Bộ phát hiện qPCR thời gian thực MycAway® Mycoplasma (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | 25T/100T | ||
| 40601ES | 10 xét nghiệm/20 xét nghiệm | ||
| Thuốc thử loại bỏ Mycoplasma | 40607ES | 1mL/5×1mL
| |
|
Thuốc thử phòng ngừa Mycoplasma | 40608ES | MycAwayTM Thuốc phòng ngừa (2000×) -Mycoplasma | 1mL/5×1mL
|
| 40605ES | MycAwayTM Dạng xịt (sẵn sàng sử dụng) | 500mL/2×500mL/10×500mL
| |
| 40609ES | Bảo vệ MycGuardTM-1 Dung dịch (100×), để khử trùng bể nước của tủ ấm CO2 | 100mL | |
| 40610ES | Bảo vệ MycGuardTM-2 Dung dịch (500×), để khử trùng trong bồn nước thông thường | 100mL |