CHO Bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ (3G)
Tóm tắt trình độ chuyên môn (Mã số: 41332ES60)
- Lý lịch
Dữ liệu tóm tắt trong báo cáo này được thực hiện bởi
- Vật liệu và phương pháp thí nghiệm
2.1 CHO Bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ (3G), Nhà cung cấp:
2.2 Bộ dụng cụ chuẩn bị mẫu DNA dư từ tính MolPure, Nhà cung cấp:
2.3 Dữ liệu gốc: phiên bản điện tử được ghi lại trong 'Báo cáo thí nghiệm' tập tin con của tập tin cha CHO Bộ dụng cụ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ (3G).
2.4 Phương pháp: Các vật liệu và phương pháp vận hành sử dụng cho thí nghiệm về cơ bản được sản xuất hoặc thiết lập bởi
- Nội dung và kết quả trình độ
3.1 Phạm vi phát hiện
Phạm vi tuyến tính của bộ dụng cụ là 3 fg/μL~300 pg/μL với R2=1, và hiệu suất khuếch đại là 99,09% với CV <15% cho mỗi phép thử nồng độ.
Hình 1 Đường cong chuẩn qPCR DNA CHO (3G)
3.2 Độ chính xác
3.2.1 Rsinh thái
3.2.1.1 Thí nghiệm phục hồi mẫu đột biến trắng
Các mẫu CHO Tiêu chuẩn DNA ở nồng độ cao và thấp: 30 pg/μL, 300 fg/μL và 3 fg/μL đã được chuẩn bị tương ứng và thử nghiệm sau khi chiết xuất bằng Bộ dụng cụ xử lý trước mẫu DNA dư thừa bằng phương pháp hạt từ (3 (các lần chiết xuất lặp lại được thực hiện cho mỗi mẫu và 3 lần thử nghiệm lặp lại được thực hiện cho mỗi lần chiết xuất), và độ thu hồi mẫu và CV được phân tích.
Đối với các nồng độ mẫu DNA khác nhau, tỷ lệ phục hồi dao động từ 70% đến 130% và CV đều <20%.
| Kiểu mẫu | Nồng độ lý thuyết | Trích xuất 1 trung bình | Trích xuất 2 trung bình | Trích xuất 3 trung bình | Nồng độ trung bình | Sơ yếu lý lịch | Sự hồi phục |
| Mẫu trống | / | / | / |
| / | / | / |
| Mẫu phục hồi 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27,51 | 28.27 | 27,62 | 2,20% | 92,06% |
| Mẫu phục hồi 2 | 300 fg/μL | 285,53 | 301,25 | 295,71 | 294,16 | 2,71% | 98,05% |
| Mẫu phục hồi 3 | 3fg/μL | 3,50 | 3,54 | 3.31 | 3,45 | 3,56% | 115,00% |
Bảng 1 Phục hồi mẫu tăng đột biến trống
3.2.1.2 Thí nghiệm phục hồi mẫu đột biến mô phỏng
Các mẫu có cùng nồng độ (300 fg/μL DNA CHO) đã được chiết xuất (3 lần chiết xuất lặp lại được thực hiện cho mỗi mẫu và 3 lần thử nghiệm lặp lại được thực hiện cho mỗi lần chiết xuất) với 5 dung dịch nền khác nhau (protein cao, axit nucleic cao, pH cao và thấp, muối cao) và độ thu hồi mẫu và CV đã được phân tích.
Tỷ lệ thu hồi mẫu DNA cho các dung dịch nền khác nhau dao động từ 70% đến 130%, với tất cả CV <20%.
| Kiểu mẫu | Nồng độ lý thuyết | Trích xuất 1 trung bình | Trích xuất 2 trung bình | Trích xuất 3 trung bình | Nồng độ trung bình | Sơ yếu lý lịch | Sự hồi phục |
| Mẫu cơ bản | / | / | / |
| / | / | / |
| Protein cao | 300fg/μL | 302,29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47% | 108,66% |
| Axit hạt nhân cao | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28% | 98,21% | |
| Muối cao | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00% | 96.90% | |
| Độ pH cao | 296,04 | 320,58 | 324,56 | 313,72 | 4,92% | 104,57% | |
| Độ pH thấp | 314,77 | 327,89 | 340,26 | 327,64 | 3,89% | 109,21% |
Bảng 2 Phục hồi mẫu đột biến cơ bản
3.3 Độ chính xác
3.3.1 Khả năng lặp lại
Lặp lại thử nghiệm 10 lần đối với tiêu chuẩn DNA CHO ở nồng độ 3 fg/μL với CV <15%.
| Sự lặp lại | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Nghĩa là | CV% |
| Giá trị phát hiện (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2,89 | 3.16 | 2,95 | 2,87 | 2,88 | 2,75 | 2,87 | 3.15 | 2,99 | 5,65% |
Bảng 3 Kết quả lặp lại
3.3.2 Độ chính xác trung gian
Ba nhà thực nghiệm đã thử nghiệm độc lập các mẫu chuẩn DNA CHO ở nồng độ cao và thấp: 300 pg/μL, 3 pg/μL và 3 fg/μL, và thực hiện ba lần lặp lại cho mỗi nồng độ, và CV của tất cả chín dữ liệu thu được đều <15%.
| Exp |
Nồng độ thực tế Nồng độ lý thuyết | CHO ADN (3G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/uL | 3fg/uL | ||
| Thử nghiệm 1 | Quyết định 1 | 302,63 | 2,97 | 3,40 |
| Quyết định 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Quyết định 3 | 287,67 | 2,99 | 3.01 | |
| Exp2 | Quyết định 4 | 292,27 | 2,92 | 3.47 |
| Quyết định 5 | 299,61 | 2,90 | 2,82 | |
| Quyết định 6 | 305,73 | 2,93 | 2,90 | |
| Exp 3 | Quyết định 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Quyết định 8 | 299,17 | 3,00 | 3.21 | |
| Quyết định 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Nghĩa là | 297,04 | 2,98 | 3.13 |
| / | CV% | 2.03 | 2,80 | 6,85 |
Bảng 4 Kết quả độ chính xác trung gian
3.4 Tính đặc hiệu
Sự can thiệp của DNA bộ gen tế bào thường được sử dụng trong sản xuất các sản phẩm sinh học đã được đánh giá về sự can thiệp với các thuốc thử phát hiện DNA CHO và nhóm can thiệp chồng chéo với nhóm đối chứng và không thấy sự can thiệp nào (hình bên dưới hiển thị, theo thứ tự, dữ liệu can thiệp của DNA bộ gen Chuột, MDCK, HEK293 và E. coli với các thuốc thử phát hiện DNA CHO).
Hình 2 Kết quả thí nghiệm giao thoa
3.5 Giới hạn định lượng
CHO DNA được phát hiện ở 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3fg/uL và 0,1 fg/μL, với 10 lần lặp lại cho mỗi nồng độ. Kết quả cho thấy CV <20% ở nồng độ 0,3 fg/μL trở lên. Nghĩa là, giới hạn định lượng của bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ CHO (3G) là 0,3 fg/μL.
|
Sự lặp lại Mục kiểm tra | CHO ADN (3G) (fg/μL) | |
| Số lượng | Tỷ lệ tính toán lại% | |
| 1 | 0,28 | 93,33% |
| 2 | 0,26 | 86,67% |
| 3 | 0,32 | 106,67% |
| 4 | 0,30 | 100,00% |
| 5 | 0,33 | 110,00% |
| 6 | 0,23 | 76,67% |
| 7 | 0,29 | 96,67% |
| 8 | 0,37 | 123,33% |
| 9 | 0,31 | 103.33% |
| 10 | 0,28 | 93,33% |
| Nghĩa là | 0,30 | / |
| CV% | 13,09% | / |
Hình 3. Kết quả xét nghiệm DNA CHO (3G) qPCR
3.6 Giới hạn phát hiện
CHO DNA được phát hiện ở 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL và 0,01 fg/μL, với 20 lần lặp lại cho mỗi nồng độ. Kết quả cho thấy tỷ lệ phát hiện là ≥19 (tức là tỷ lệ phát hiện ≥95%) trong 20 giếng lặp lại ở nồng độ 0,05 fg/μL trở lên. Nghĩa là, giới hạn phát hiện của bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ CHO (3G) là 0,05 fg/μL.
Hình 4. Kết quả xét nghiệm qPCR DNA CHO (3G)
3.7 Độ bền
Bộ dụng cụ này đã được thử nghiệm và phù hợp với, nhưng không giới hạn ở, các dụng cụ sau:
| Người bán | Mô hình nhạc cụ | Hiệu quả khuếch đại | R2 | Giới hạn định lượng | Sơ yếu lý lịch | Giới hạn phát hiện | Tỷ lệ phát hiện |
| Nhiệt độ | ABI 7500 | 99,69% | 1 | 0,3fg/μL | 12,40% | 0,05fg/μL | 95,65% |
| Nhiệt độ | ABI QuantStudio5 | 99,26% | 1 | 0,3fg/μL | 15,30% | 0,05fg/μL | 100,00% |
| Roche | LightCycler480 | 2,05% | 0,978 | 0,3fg/μL | / | 0,05fg/μL | / |
| Thượng Hải Hồng Thạch | LẬP TRÌNH | 101,14% | 0,999 | 0,3fg/μL | 14,41% | 0,05fg/μL | 95,65% |
Bảng 5 Kết quả thử nghiệm tính phù hợp của dụng cụ
3.8 Tính ổn định
3.8.1 Độ ổn định khi đóng băng-tan băng
Bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ CHO (3G) đã được thử nghiệm bằng cách đông lạnh và rã đông nhiều lần 10 lần và hiệu suất của bộ sản phẩm không bị ảnh hưởng.
|
Chỉ số thử nghiệm Thời gian đông lạnh-tan băng | Tham số | Thời gian T0 | Đông lạnh-rã đông 10 lần |
| Tham số đường cong chuẩn | Hiệu quả khuếch đại | 95,70% | 98,62% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Giới hạn định lượng (0,3 fg/μL) | Sơ yếu lý lịch | 15,31% | 17,16% |
| Giới hạn phát hiện (0,05 fg/μL) | Tỷ lệ phát hiện | 95,65% | 100% |
Bảng 6 Phân tích kết quả độ ổn định đông lạnh-tan băng
3.7.2 Ổn định tăng tốc
Bộ phát hiện dư lượng DNA tế bào chủ CHO (3G) được bảo quản ở nhiệt độ 2~8°C trong 30 ngày và 37°C trong 14 ngày. Không có hiệu suất nào của bộ bị ảnh hưởng.
|
Chỉ số thử nghiệm Nhiệt độ và thời gian tăng tốc | Tham số | Thí nghiệm 1 | Thí nghiệm 2 | ||
| Thời gian T0 | 2~8℃ 30 Ngày | Thời gian T0 | 37℃ 14 Ngày | ||
| Tham số đường cong chuẩn | Hiệu quả khuếch đại | 100,53% | 102,61% | 101,76% | 101,84% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Giới hạn định lượng (0,3 fg/μL) | Sơ yếu lý lịch | 17,16% | 12,63% | 16,27% | 12,49 |
| Giới hạn phát hiện (0,05 fg/μL) | Tỷ lệ phát hiện | 95,65% | 100% | 95,57% | 100% |
Bảng 7 Phân tích kết quả ổn định tăng tốc
3.9 Giới hạn của khoảng trống
3.9.1 Không có Kiểm soát Mẫu (NTC)
Không có mẫu kiểm soát (NTC) là pha loãng DNA với 96 lần lặp lại để thực hiện xét nghiệm định lượng qPCR, tất cả các giá trị CT trên 96 giếng lặp lại được thử nghiệm đều >40.
Hình 5 Kết quả thí nghiệm NTC
3.9.2 Mẫu đối chứng chiết xuất âm tính (NCS)
Mẫu đối chứng chiết xuất âm tính (NCS) là mẫu pha loãng DNA, trước tiên được chiết xuất bằng cách xử lý mẫu trước, sau đó thực hiện qPCR, tất cả các giá trị CT trên 48 giếng lặp lại được thử nghiệm đều >40.
Hình 6 NCS kết quả thí nghiệm
- 4.Thẩm quyền giải quyết
4.1 Ủy ban Dược điển Trung Quốc (ChPC). Dược điển Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa (Tập Ⅲ) [S]. Bắc Kinh：Nhà xuất bản Khoa học và Công nghệ Y học Trung Quốc，tr.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Nguyên tắc chung về đánh giá kỹ thuật xác nhận phương pháp phân tích để kiểm soát chất lượng sản phẩm sinh học.
4.3 ICH(2022)《Xác thực phương pháp phân tích Q2》, bản thảo.
Thông tin đặt hàng
| Sự miêu tả | Mã số sản phẩm |
| 41332ES | |
| 41331ES | |
| 41307ES | |
| 41308ES | |
| 18461ES | |
| Bộ phát hiện Mycoplasma qPCR MycAway™ (2G) | 40619ES |