Mycoplasma, auch als Pleuropneumonia-ähnliche Organismen (PPLO) bekannt, sind die kleinsten und einfachsten bisher entdeckten Prokaryoten, denen eine Zellwand fehlt. Sie haben einen Durchmesser von 0,1 bis 0,3 μm, können Filter passieren und weisen einen hohen Pleomorphismus auf. Sie sind relativ häufig und es ist schwierig, bakterielle Verunreinigungen in Säugetierzellkulturen zu erkennen.
Mykoplasmenkontamination hat zahlreiche negative Auswirkungen auf Zellkulturen und ist zu einem ernsthaften Problem in der Zellkulturpraxis geworden. Vorsichtigen Schätzungen zufolge liegt die Mykoplasmenkontaminationsrate in routinemäßigen Zellkulturen bei 15 % bis 35 %, was die Glaubwürdigkeit der Versuchsergebnisse ernsthaft beeinträchtigt.
Etwa 95 % der Mykoplasmen-Kontaminationen in Zellkulturen werden hauptsächlich durch Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis und Mycoplasma hyorhinis verursacht. Auf Kulturmedien bilden Mykoplasmenkolonien ein „Spiegelei“-Erscheinungsbild. Zellkulturüberstände und Zellmembranen bieten eine geeignete Umgebung für das Wachstum von Mykoplasmen, und Mykoplasmen, die die Oberfläche von Zellen parasitieren, können die Wirtszellmembran durchdringen.
Zu den Hauptquellen einer Mykoplasmen-Kontamination zählen: Zellkulturmedien oder deren Bestandteile (wie etwa Rohstoffe für das Medium, Serum und andere Reagenzien), Laborpersonal, Zellkultur-Inkubatoren, Lagertanks für flüssigen Stickstoff, in der Luft befindliche Partikel und Aerosole, übermäßiger Einsatz von Antibiotika, unsachgemäß versiegelte Zellkulturen und Zellen, die bereits mit Mykoplasmen kontaminiert sind.
Zu den entsprechenden Gefahren dieser Kontaminationen zählen: Sie führen zur Verschrottung von Zellprodukten oder von Produkten, die unter Verwendung von Zellen als Medium hergestellt wurden, da sich Mykoplasmen bei der nachfolgenden Reinigung nicht wirksam entfernen lassen. Sie kontaminieren alle damit verbundenen Geräte und Anlagen sowie Zwischen- und Endprodukte, die mit dem kontaminierten Material in Kontakt kommen. Sie verursachen eine Kontamination anderer normaler Zellen durch Mykoplasmen. Sie führen zur Verschrottung wichtiger Zell- oder Virensamenbanken aufgrund einer Mykoplasmenkontamination. Sie zwingen das Labor, die Produktion oder experimentelle Vorgänge einzustellen, um die Mykoplasmenkontamination zu beseitigen. Sie führen zur Entwicklung einer Mykoplasmenresistenz, wodurch diese noch schwieriger zu beseitigen ist. Sie erweitern den Bereich der Mykoplasmenkontamination und stellen eine Bedrohung für andere Zellkulturen im Labor dar.
Daher müssen regelmäßige Tests und Entfernungen auf Mykoplasmen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass im Zellkultursystem kein Mykoplasma vorhanden ist, was für den normalen Ablauf der wissenschaftlichen Forschung unabdingbar ist.
Mykoplasmen Erkennung
Mykoplasmen sind eine relativ häufige, aber normalerweise schwer zu entfernende Kontaminationsart. Bei biologischen Prozessen mit Zellkulturen verlangen die Vorschriften, dass „keine Mykoplasmenkontamination vorhanden sein darf“.
- In der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs, Band III, „Vorbereitung und Qualitätskontrolle von tierischen Zellsubstraten für die Herstellung und Prüfung biologischer Produkte“, ist festgelegt, dass für in der Produktion verwendete Zellen Mykoplasmentests an der Master Cell Bank (MCB), der Working Cell Bank (WCB) und den End-of-Production Cells (EOPC) durchgeführt werden müssen.
- Die FDA-Richtlinien für die Industrie: Charakterisierung und Qualifikation von Zellsubstraten und anderen biologischen Materialien, die bei der Herstellung viraler Impfstoffe für Infektionskrankheiten verwendet werden, schreiben vor, dass eine Mykoplasmenbekämpfung bei Rohmaterialien, Virussamen, unverarbeiteten Ernteflüssigkeiten und anderen derartigen Materialien durchgeführt werden muss.
- In ICH Q5D „Ableitung und Charakterisierung von Zellsubstraten zur Herstellung biotechnologischer/biologischer Produkte“ wird auch erwähnt, dass eine Mykoplasmenkontrolle bei Rohmaterialien, Virussamen, unverarbeiteten Ernteflüssigkeiten und anderen derartigen Materialien durchgeführt werden muss.
Abbildung 1 Von nationalen und internationalen Vorschriften geforderte Testpunkte für Mykoplasmen-Kontamination
Zu den herkömmlichen Mykoplasmen-Nachweismethoden zählen hauptsächlich Kulturmethoden und Indikatorzellmethoden. Aufgrund der langen Nachweiszyklen oder Empfindlichkeitsprobleme dieser beiden Methoden führen sie jedoch zu verlängerten Produktions- oder Produktfreigabezyklen für Unternehmen. Mit der Entwicklung der Zell- und Gentherapie sind die Anforderungen der Industrie an die Aktualität und Empfindlichkeit des Mykoplasmen-Nachweises immer strenger geworden. Kurze Haltbarkeitsdauern reichen nicht aus, um derart lange Nachweiszeiträume zu unterstützen, weshalb sich die schnelle NAT-Methode (Nukleinsäuretest) unter den verschiedenen Mykoplasmen-Nachweismethoden hervorgetan hat.
Abbildung 2 In nationalen und internationalen Vorschriften aufgeführte Mykoplasmen-Nachweismethoden
Basierend auf NAT (Nukleinsäureamplifikationstechniken) hat
Es handelt sich um ein Produkt zum schnellen qualitativen Nachweis einer möglichen Mykoplasmen-Kontamination in Produktionsrohstoffen, Zellbanken, Virussamen, Virus- oder Zellernteflüssigkeiten und therapeutischen Zellen. Es wird hauptsächlich in den Forschungs-, Entwicklungs-, Produktions- und Freigabeprozessen von Biopharmazeutika verwendet.
Produktqualifikationen
Einhaltung gesetzlicher Vorschriften: Validiert gemäß den Anforderungen der Arzneibücher EP2.6.7, JP G3 und USP 63 und erfüllt die Standards internationaler maßgeblicher Organisationen.
Audit-Konformität: Die Produktherstellung entspricht den Qualitätsmanagementsystemstandards ISO13485 und wird durch eine umfassende Auditdokumentation unterstützt.
Qualitätssicherung: Alle für das Kit erforderlichen Enzymrohstoffe werden selbst hergestellt und industrialisiert, wodurch eine stabile Versorgung gewährleistet wird.
Technischer Erfahrungsschatz: Die TaqMan-Methode verfügt über eine solide technische Grundlage und die Empfindlichkeit des Kits kann 10 KBE/ml und weniger erreichen.
Fokus auf Produktleistung: Die Taq-Enzym-Antikörper-Bibliothek mit dual blockierenden Antikörpern verbessert die Spezifität, Empfindlichkeit und Stabilität des Kits.
Produkteigenschaften
Mehrere Erkennungstypen: Optimierte TaqMan-Sonden können bis zu 183 Mykoplasmenarten erkennen.
Einfach zu bedienen: Die Gesamtzeit für die Probenvorbereitung und -untersuchung beträgt weniger als drei Stunden. Dadurch entfällt die 28-tägige Wartezeit, die bei Kulturmethoden üblich ist.
Hohe Empfindlichkeit: Die Nachweisgrenze liegt bei nur 10 KBE/ml, was es zu einer sinnvollen Alternative zu direkten Kulturmethoden macht.
Hohe Spezifität: Primer und Sonden sind auf 16S rRNA ausgerichtet und stellen sicher, dass keine Kreuzreaktionen mit eng verwandten Arten wie Clostridien und Laktobazillen auftreten.
Hohe Sicherheit: Die positive Kontrolle (PC) im Kit ist nicht infektiös, wodurch das Kontaminationsrisiko vollständig eliminiert wird.
Hohe Störfestigkeit: Die Einführung einer internen Kontrolle (IC) trägt dazu bei, Probeninterferenzen und Anomalien bei der Reaktionsvorbereitung auszuschließen und so falsch-negative Ergebnisse wirksam zu vermeiden.
Abbildung 3: Arbeitsablauf für den Mykoplasmennachweis mit dem Mykoplasma Real-time qPCR Detection Kit
2.MycAway™ Plus-Color Ein-Schritt-Mykoplasmen-ErkennungskitEs verwendet eine einzigartige isothermische Verstärkungstechnologie, die eine bessere Farbunterscheidung ermöglicht. Der Wechsel von Blauviolett (negativ) zu Himmelblau (positiv) ist mit bloßem Auge leichter erkennbar. Darüber hinaus enthält es Antikontaminationskomponenten, um das Auftreten falscher Positivergebnisse zu verhindern.
Abbildung 4: Vorgehensweise zum Nachweis von Mykoplasmen mit dem MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit
3.GMyc-PCR Mykoplasmen ErkennungBausatzIm Gegensatz zu herkömmlichen einstufigen PCR-Nachweisverfahren wird die Anzahl der Primer von einem Paar auf drei Paare erhöht, wobei die konservierten Regionen der Mycoplasma 16S- und 23S-rRNA für die verschachtelte PCR-Amplifikation anvisiert werden. Dies reduziert nicht nur unspezifische Produkte, sondern erhöht auch die Empfindlichkeit des Produkts erheblich, sodass bereits eine einzige Kopie von Mycoplasma nachgewiesen werden kann.
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Abbildung 5: Vorgehensweise zum Nachweis von Mykoplasmen mit dem GMyc-PCR Mykoplasmen-Testkit
Mykoplasmen-Entfernung
Im Prozess der Zellkultur kann eine großflächige Mykoplasmen-Kontamination durch regelmäßige Tests wirksam verhindert werden. Wenn die Zellen jedoch bereits mit Mykoplasmen kontaminiert sind, müssen sie umgehend behandelt werden. Die beste Vorgehensweise besteht darin, die kontaminierten Zellen unter hohem Druck zu sterilisieren und sie dann zu entsorgen, um eine Kontamination anderer sauberer Zelllinien zu vermeiden. Wenn die kontaminierten Zellen besonders wertvoll sind und die Mykoplasmen-Kontamination entfernt werden muss, kann eine Kombination von Antibiotika verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen. Da Mykoplasmen keine Zellwand haben, sind herkömmliche Antibiotika im Allgemeinen unwirksam gegen sie. Daher ist die Auswahl eines geeigneten Reagenzes zur Mykoplasmen-Entfernung von entscheidender Bedeutung.
Produkteigenschaften
Geringe Toxizität: Minimale Toxizität für Zellen, wodurch sichergestellt wird, dass nachfolgende Zellexperimente wie Transfektion und Lebensfähigkeitstests nicht gestört werden.
Hohe Stabilität: Das Reagenz kann lange Zeit bei -20 °C gelagert werden und behält seine hohe Wirksamkeit.
Einfach zu bedienen: Geben Sie das Produkt einfach zum mit Mykoplasmen kontaminierten Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie es.
Schnell wirkend: „Sofortige Ergebnisse“, die bereits innerhalb von 3 Tagen sichtbar sind.
Breites Spektrum: Kann die meisten in Laboren vorkommenden Mykoplasmenarten entfernen.
Abbildung 6.Abbildung des Zytotoxizitätstests mit Mykoplasmen-Entfernungsreagenz
Mykoplasmen-Prävention
Im Prozess der Zellkultur kommt es häufig zu einer Mykoplasmen-Kontamination. Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften ist es jedoch mit bloßem Auge oder mikroskopischen Geräten schwer zu erkennen. Daher ist es besonders wichtig, bei der Mykoplasmen-Prävention gute Arbeit zu leisten. Eine wirksame Prävention einer Mykoplasmen-Kontamination kann durch Zugabe von Mykoplasmen-Präventionsreagenzien zum Kulturmedium erreicht werden.
Derzeit entstehen Mykoplasmen in Laboren hauptsächlich durch: Kreuzkontamination zwischen Zellen, Kontamination der Arbeitsumgebung oder Laborgeräte, schlechte aseptische Techniken durch Experimentatoren, kontaminierte Kulturmedien oder Reagenzien und Originalgewebe oder -organe mit Mykoplasmenkontamination. Die von
Produktinformationen
| Produkt | Katalognummer | Produktname | Produktspezifikation |
| Probenvorbehandlungskit | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 Probenvorbereitungskit FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Instrument zur Nukleinsäureextraktion | 80511ES | 48-Kanal-Automatischer Nukleinsäureextraktor | 48 Kanal |
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Mykoplasmen-Nachweiskit | 40619ES | MycAway® Mycoplasma Echtzeit-qPCR-Erkennungskit (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | 25T/100T | ||
| 40601ES | 10 Tests/20 Tests | ||
| Reagenz zur Mykoplasmen-Entfernung | 40607ES | MycAwayTM Behandlung (1000×) – Mycoplasma-Entfernungsreagenz | 1 ml/5 × 1 ml
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Mykoplasma-Präventionsreagenz | 40608ES | MycAwayTM Prophylaktisch (2000×) -Mycoplasma-Präventionsreagenz | 1 ml/5 × 1 ml
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| 40605ES | MycAwayTM Spray (gebrauchsfertig) | 500 ml/2 × 500 ml/10 × 500 ml
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| 40609ES | MycGuardTM-1 Lösung (100×) zur Desinfektion des Wasserbads eines CO2-Inkubators | 100 ml | |
| 40610ES | MycGuardTM-2 Lösung (500×), zur Desinfektion eines normalen Wasserbads | 100 ml |