Bei der direkten PCR handelt es sich um eine Reaktion, bei der Blut, tierisches oder pflanzliches Gewebe usw. direkt zur Amplifikation verwendet wird, ohne dass Schritte zur Nukleinsäureextraktion und Nukleinsäurereinigung erforderlich sind. Sie bietet beispiellosen Komfort bei der DNA-Amplifikation, was viel Zeit sparen kann. Welche Reagenzien und Produkte werden also bei der direkten PCR verwendet?

1. Was ist direkte PCR
2. Welche Reagenzien werden für die direkte PCR benötigt
3. Anwendungsszenarien und Eigenschaften des Direct PCR Kit
4. Produktdaten
5. Kundenfeedback
6. Produktbestellinformationen

1. Was ist direkte PCR

Nach kontinuierlicher Ergänzung und Verbesserung durch unzählige Wissenschaftler auf der ganzen Welt ist die PCR-Technologie zur am weitesten verbreiteten, am häufigsten verwendeten und wichtigsten Methode der Grundlagenforschung im gesamten Bereich der Biowissenschaften geworden. Touch Down PCR, RT-PCR, Echtzeit-PCR, Multi-PCR usw., die auf der Grundlage der breiten Anwendung der traditionellen PCR-Technologie entwickelt wurden, sowie die neueste digitale PCR (Digital PCR) haben die Forschung der meisten wissenschaftlichen Forscher erheblich bereichert. Diese Methoden haben die Entwicklung der modernen Biowissenschaften, insbesondere der Molekularbiologie, erheblich beschleunigt und große Beiträge zur Erforschung des Lebens und der Natur für den gesamten Menschen geleistet. Die traditionelle PCR-Technologie und verschiedene neue Technologien und neue Anwendungen, die daraus abgeleitet werden, haben eine Voraussetzung, nämlich dass im Voraus hochreine Nukleinsäurevorlagen beschafft werden müssen. Jede biologische Probe muss eine Reihe komplexer und langwieriger Probenverarbeitungen durchlaufen, um Nukleinsäureproben zu erhalten, die den technischen Anforderungen der PCR entsprechen. Die Trennung und Extraktion von DNA und RNA war schon immer die grundlegende Arbeit, die das entsprechende wissenschaftliche und technische Personal jeden Tag wiederholen muss. Aufgrund der großen Unterschiede zwischen den Proben ist auch der Trennungs- und Extraktionsprozess von DNA und RNA sehr unterschiedlich. Diese Arbeit erfordert ein hohes Maß an technischem Können von den Bedienern. Aufgrund der Verwendung einiger hochgiftiger chemischer Reagenzien in der herkömmlichen Trenn- und Extraktionstechnologie führt eine langfristige Exposition zu irreversiblen Schäden am Körper des Bedieners und sogar zu direkten Schäden während des Experiments. Chemische Reagenzien wie Phenol und Chloroform sind wichtige Karzinogene im Labor, und der flüssige Stickstoff, der beim Prozess der Nukleinsäuretrennung und -extraktion von Pflanzengewebe verwendet wird, stellt aufgrund seiner ultraniedrigen Temperatur eine größere Bedrohung für die Sicherheit der Bediener während des Experiments dar. Gleichzeitig ist die Trennung und Extraktion von Nukleinsäuren für diejenigen, die eine große Anzahl von Proben untersuchen müssen, eine arbeitsintensive Aufgabe. Mittlerweile sind die Nukleinsäure-Isolierungs- und Extraktionskits auf dem Markt ausgereift und es gibt viele Marken, aber sie sind alle ungefähr gleich. Ob es sich um ein Silica-Membransäulen-Zentrifugenkit oder ein Magnetperlen-Methodenkit handelt, es ist viel Zeit erforderlich und die Kosten sind hoch. Zusätzlich zu den Kosten des Kits gibt es spezielle Anforderungen an die Laborausrüstung. Die automatisierte Arbeitsstation, die bei der Magnetperlenmethode verwendet wird, ist ein sehr typisches groß angelegtes, hochwertiges Gerät, das für das Labor enorme Kosten verursacht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Probenvorbehandlung vor der Durchführung von PCR-Experimenten für Forscher ein unvermeidlicher und ständiger Ärger ist. Wie man dieses Problem löst und PCR-Experimente direkt ohne Trennung und Extraktion von Nukleinsäuren durchführt, war schon immer ein Problem, über das viele wissenschaftliche Forscher und klinische Labormitarbeiter nachgedacht haben.

Direkte PCR ist eine Reaktion, bei der tierische oder pflanzliche Gewebe ohne Nukleinsäureextraktion direkt zur Amplifikation verwendet werden. In vielerlei Hinsicht funktioniert die direkte PCR wie die herkömmliche PCR.Der Hauptunterschied besteht in dem benutzerdefinierten Puffer, der bei der direkten PCR verwendet wird. Die Probe kann direkt einer PCR-Reaktion unterzogen werden, ohne dass eine Nukleinsäureextraktion erforderlich ist. Es gelten jedoch entsprechende Anforderungen an die Verträglichkeit der an der direkten PCR-Reaktion beteiligten Enzyme und die Kompatibilität des Puffers. Obwohl in üblichen Proben mehr oder weniger PCR-Inhibitoren vorhanden sind, kann bei der direkten PCR unter Einwirkung von Enzymen und Puffern dennoch eine zuverlässige Amplifikation erzielt werden. Bei der herkömmlichen PCR-Reaktion muss jedoch hochwertige Nukleinsäure als Vorlage für die Reaktion verwendet werden. Wenn die Vorlage Proteine ​​und andere Verunreinigungen enthält, wird der reibungslose Ablauf der PCR-Reaktion beeinträchtigt.

Das früheste Anwendungsgebiet der direkten PCR ist der Bereich Tiere und Pflanzen, wie Blut, Gewebe und Haare von Mäusen, Katzen, Hühnern, Kaninchen, Schafen, Rindern und anderen Tieren; Blätter und Samen von Pflanzen usw. Sie wird zur Untersuchung von Genotypisierung, Transgenen, Plasmiderkennung, Gen-Knockout-Analyse, DNA-Quellenidentifizierung, Artenidentifizierung, SNP-Analyse und anderen Bereichen verwendet. Diese Bereiche haben einige gemeinsame Merkmale, d. h. der Gehalt des Zielgens ist relativ hoch und die Nukleinsäureextraktion ist mühsam. Daher kann die direkte PCR nicht nur Zeit sparen und die Ergebnisse kaum beeinflussen, sondern auch Kosten sparen.

2. Welche Reagenzien werden für die direkte PCR benötigt

2.1 Probenlysat

Das Probenlysat kann selbst hergestellt oder gekauft werden. Die unterschiedlichen Bestandteile der Lysate verschiedener Marken führen zu unterschiedlichen Lysefähigkeiten und damit auch zu geringfügig unterschiedlichen Lysezeiten. Beispielsweise wird für die Präparation tierischer Gewebeproben im Allgemeinen eine Lysezeit von 30 Minuten oder über Nacht empfohlen, für Viren beträgt die Lysezeit 3–10 Minuten.

2.2 PCR-Mastermix

Es wird empfohlen, eine Hot-Start-DNA-Polymerase zu verwenden, um die spezifische Amplifikation und die Amplifikationsfähigkeit zu verbessern. Das Herzstück der direkten PCR ist eine hochresistente Polymerase.

2.3 Entfernen oder Hemmen von Komponenten in Proben, die die DNA-Amplifikation beeinträchtigen

Nachdem die Probe durch das Lysat verarbeitet wurde, werden Proteine, Lipide und andere Zelltrümmer freigesetzt, und diese Substanzen hemmen die PCR-Reaktion. Daher müssen bei der direkten PCR entsprechende Entfernungs- oder Inhibitoren hinzugefügt werden, um den Einfluss dieser Faktoren zu verringern.

3. Anwendungsszenarien und Eigenschaften des Direct PCR Kit

Das Direct PCR Kit von Yeasen kann Pflanzen-, Tiergewebe- oder Blutproben sowie andere Originalproben ohne Nukleinsäurereinigung direkt amplifizieren, was den PCR-Experimentprozess erheblich vereinfacht. Die PCR-basierte Genotypisierung (Abbildung 1) wurde unter Verwendung der Originalprobe ohne Genomreinigung (Abbildung 1A) oder unter Verwendung ihres Lysats (Abbildung 1B) als Vorlage durchgeführt. Im Vergleich zur allgemeinen PCR-basierten Genotypisierung weist das Direct PCR Kit einen geringeren Probenverbrauch, eine einfache Handhabung, niedrige Experimentierkosten und eine qualitativ hochwertige quantitative Probenerkennung auf.

Abbildung 1. Direkte PCR-Technologie.

A. Direkte Methode: Nehmen Sie eine kleine Anzahl Proben und geben Sie diese zur PCR-Identifizierung direkt zum PCR-Mix hinzu. B. Lysemethode: Geben Sie die Probe zur Lyselösung, um das Genom freizusetzen, und geben Sie zur PCR-Identifizierung eine kleine Menge des Lyseüberstands zum PCR-Mix hinzu.

3.1 Anwendungen

Erkennung von Genamplifikationen bei Tieren, Genotypisierung transgener Tiere, Identifizierung transgener Pflanzen, Genotypisierung von Pflanzen usw.

3.2 Funktionen

★   Direkt: keine DNA-Reinigung;
★   Schnell: 10 Minuten bis zur Fertigstellung der Vorlagenvorbereitung, 50 Minuten bis zur Fertigstellung der PCR-Reaktion;
★   Einfach: Proben können ohne Scheren oder Mahlen lysiert werden;
PCR Mix liegt in Form eines Mastermix vor, der die Anzahl der Probenzugabeschritte reduziert
★   Einsparung: weniger Materialverbrauch
★   Hoher Durchsatz: Lysereaktion kann in 96-Well-Platten durchgeführt werden
★   Starke Inhibitortoleranz

4. Produktdaten

4.1 Universaltyp für mehrere Tiere: Animal Tissue Direct PCR Kit

4.1.1 Am schnellsten: Operationszeit verkürzen

Abbildung 2. Ein direktes PCR-Kit für tierisches Gewebe von Yeasen könnte mehr Zeit sparen.

4.1.2 Beispiel: Genotypidentifizierung von Knockout-Mäusen

Abbildung 3. Die Ergebnisse der direkten Amplifikation von tierischem Gewebe mithilfe des direkten PCR-Kits zum Nachweis von Tieren mit Gen-Knockout.

M: 100 bp DNA-Leiter. Spuren 1-8: Lysat als Vorlage. +: 50 ng gereinigte genomische DNA als Vorlage. ﹣: Deionisiertes Wasser als Vorlage. Mehrere Zyklen: 35 Zyklen. Einzelnes Fragment (580 bp): homozygotes Knockout-Tiergenom. Einzelnes Fragment (180 bp): Wildtypgenom. Zwei Fragmente (580 bp/180 bp): heterozygotes Knockout-Tiergenom.

4.2 Nagetierspezifisch: Mouse Tissue Direct PCR Kit

4.2.1 Schneller: Ausreichende Genfreisetzung

Abbildung 4: Ergebnisse der direkten Amplifikation des Mausgewebe-Direkt-PCR-Kits mit unterschiedlichen Lysezeiten.

M: 100 bp DNA-Leiter. +: 50 ng gereinigte genomische DNA als Vorlage. Mehrere Zyklen: 35 Zyklen.

4.2.2 Besser als die allgemeine alkalische Lysemethode

Abbildung 5. Ergebnisse der SOX21-Genamplifikation des Mäuseschwanzes, der mit verschiedenen Lysemethoden behandelt wurde.

M: 100 bp DNA-Leiter. Spuren 1-2: Lysat als Vorlage durch allgemeine alkalische Lyse. Spuren 3-4: Lysat als Vorlage durch direkte PCR-Kit für Mausgewebe. +: 50 ng gereinigte genomische DNA als Vorlage. -: Deionisiertes Wasser als Vorlage. Mehrere Zyklen: 35 Zyklen.

4.2.3 Vergleich mit ähnlichen Produkten

Abbildung 6. Ergebnisse der SOX21-Genamplifikation eines Mäuseschwanzes, der mit ähnlichen Produkten verschiedener Marken behandelt wurde.

M: 100 bp DNA-Leiter. +: 50 ng gereinigte genomische DNA als Vorlage. Mehrere Zyklen: 35 Zyklen.

4.3 Direktes PCR-Kit für Pflanzengewebe

4.3.1 Überprüfung von Pflanzenproben verschiedener Typen

Abbildung 7. Ergebnisse der direkten Amplifikation von Blättern verschiedener Pflanzen.

M: 100 bp DNA-Leiter. C: Die gereinigte genomische DNA als Vorlage.Spuren 1-2: Das Blattgewebelysat als Vorlage. Mehrere Zyklen: 30 Zyklen.

5. Kundenfeedback

5.1 Genotypisierung von Mäusen

Abbildung 8. Die Ergebnisse der Mausgenotypidentifizierung mithilfe des direkten PCR-Kits für Mausgewebe durch Benutzer von Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 Direkte PCR für Reis

Abbildung 9. Amplifikation von Reis-bezogenen Genen mithilfe von direkten PCR-Kits für Pflanzengewebe durch Benutzer der Huazhong Agricultural University.

6. Produktbestellinformationen

Yeasen ist ein Biotechnologieunternehmen, das sich mit der Forschung, Entwicklung, Produktion und dem Vertrieb von drei wichtigen biologischen Reagenzien beschäftigt: Moleküle, Proteine ​​und Zellen. Die von Yeasen angebotenen Produkte sind wie folgt.

Tabelle 1. Produktbestellinformationen