Giới thiệu về Apoptosis
Apoptosis là hiện tượng chết tế bào theo chương trình xảy ra trong quá trình phát triển của một tế bào hoặc khi nó bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố nhất định và được kích hoạt bởi sự điều hòa của các gen nội bào và các sản phẩm của chúng. Trong con đường apoptosis, các sự kiện xảy ra theo thứ tự thời gian, từng cái một, dẫn đến sự xuất hiện của các túi apoptosis, và sau đó apoptosis xảy ra. Apoptosis đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển phôi và hình thái, duy trì quần thể tế bào bình thường ổn định trong các mô, khả năng phòng vệ và phản ứng miễn dịch của cơ thể, tổn thương tế bào do bệnh tật hoặc ngộ độc, lão hóa và sự phát triển của khối u, và có giá trị điều trị tiềm năng.
Nguyên lý phát hiện
Sự phân bố của phospholipid trong màng tế bào bình thường là không đối xứng. phosphatidylserine (PS) nằm trên bề mặt bên trong của màng tế bào trong tế bào sống và trong quá trình apoptosis, màng tế bào trải qua một sự thay đổi và PS bị lật từ bề mặt bên trong của màng tế bào ra bề mặt bên ngoài của màng tế bào. Annexin V nhận biết đặc hiệu PS trên bề mặt của các tế bào chết theo chương trình, trong khi PS từ các tế bào sống nằm trên bề mặt bên trong của màng tế bào và không thể liên kết đặc hiệu với Annexin V.
PS của tế bào hoại tử cũng lật từ bề mặt bên trong của màng tế bào ra bề mặt bên ngoài của màng tế bào, và Annexin V cũng nhận ra PS trên bề mặt của tế bào hoại tử, vì vậy Annexin V không thể phân biệt giữa tế bào hoại tử và tế bào chết theo chương trình. Ngược lại, thuốc nhuộm PI có thể liên kết với DNA nội bào và phân biệt giữa tế bào hoại tử và tế bào sống. Màng tế bào của tế bào chết theo chương trình sớm và tế bào sống vẫn còn nguyên vẹn và thuốc nhuộm PI không thể tự do đi qua màng tế bào để vào tế bào và liên kết với DNA, vì vậy thuốc nhuộm PI không thể gắn nhãn tế bào chết theo chương trình và tế bào sống, trong khi thuốc nhuộm PI có thể đi qua màng tế bào của tế bào hoại tử và liên kết với DNA bên trong tế bào, và thuốc nhuộm PI trong tế bào hoại tử sẽ phát ra huỳnh quang màu đỏ sau khi được kích thích bởi tia laser 488 nm, sẽ được kênh tương ứng tiếp nhận. Vì vậy, Annexin V và PI có thể được sử dụng đồng thời để phân biệt giữa tế bào sống, tế bào chết theo chương trình sớm và tế bào chết theo chương trình muộn hoặc tế bào hoại tử.
Hình 2 Nguyên lý phát hiện Annexin V/PI
Phát hiện tế bào dòng chảy
Bước sóng kích thích cực đại của FITC là 488 nm, bước sóng phát xạ cực đại là 525 nm và huỳnh quang màu xanh lá cây của FITC được phát hiện trong kênh FL1. Bước sóng kích thích cực đại của phức hợp PI-DNA là 535 nm, bước sóng phát xạ cực đại là 615 nm và huỳnh quang đỏ của PI được phát hiện trong kênh FL2 hoặc FL3. Phân tích được thực hiện bằng phần mềm như CellQuest và một biểu đồ phân tán hai màu được vẽ với FITC là tọa độ ngang và PI là tọa độ dọc. Trong các thí nghiệm điển hình, các tế bào có thể được chia thành ba phân nhóm, với các tế bào sống chỉ có huỳnh quang nền cường độ rất thấp, các tế bào chết theo chương trình sớm chỉ có huỳnh quang màu xanh lá cây mạnh và các tế bào chết theo chương trình muộn có nhuộm kép với huỳnh quang màu xanh lá cây và đỏ.
Hình 3 Phát hiện tế bào dòng chảy
Những câu hỏi thường gặp
H: Xét nghiệm apoptosis Annexin V có thể áp dụng cho thực vật hoặc vi khuẩn (sinh vật nhân sơ) không?
A: Có, nhưng cần phải chuẩn bị protoplast vì tế bào thực vật hoặc vi khuẩn (prokaryote) có chứa thành tế bào. Liều lượng cụ thể của dung dịch nhuộm chỉ cần ngâm tế bào, và thời gian nhuộm có phần khác nhau đối với các tế bào khác nhau.
H: Làm thế nào để đánh giá kết quả của thí nghiệm?
A: Tế bào sống (Annexin V-/PI-), tế bào apoptosis sớm (Annexin V+/PI-), tế bào apoptosis muộn và tế bào hoại tử cho thấy tình trạng dương tính kép (Annexin V+/PI+), nhân trần (Annexin V-/PI+).
H: Sự khác biệt giữa Annexin V và TUNEL là gì?
A: Đánh dấu đầu mút dUTP (TUNEL) bằng deoxynucleotidyl transferase đầu cuối là phương pháp nhuộm được sử dụng để xác định các vị trí phân mảnh DNA nội bào - một đặc điểm đặc trưng của quá trình apoptosis muộn.
Phương pháp nhuộm Annexin V giúp nhận biết giai đoạn đầu của quá trình apoptosis bằng cách liên kết với các gốc PS lộ ra bên ngoài tế bào do mất tính bất đối xứng của màng tế bào.
H: Có thể thực hiện xét nghiệm chỉ bằng Annexin V-FITC mà không phát hiện PI không?
A: Có, có thể. Đối với các mẫu xét nghiệm đặc biệt, chẳng hạn như hồng cầu không có nhân, hoặc sử dụng thuốc Doxorubicin (Adriamycin) gây trở ngại cho việc phát hiện PI, có thể thực hiện xét nghiệm chỉ bằng Annexin V-FITC trong cả hai trường hợp.
Chi tiết sản phẩm
| Tên sản phẩm | Mã số mặt hàng | Đặc điểm kỹ thuật |
| Bộ phát hiện apoptosis Annexin V-FITC/7-AAD | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Bộ phát hiện apoptosis Annexin V-PE/7-AAD | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Bộ phát hiện apoptosis Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Bộ phát hiện apoptosis Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |