Einführung in die Apoptose
Apoptose ist ein programmiertes Zelltodphänomen, das während der Entwicklung einer Zelle oder unter Einfluss bestimmter Faktoren auftritt und durch die Regulierung intrazellulärer Gene und ihrer Produkte ausgelöst wird. Im Verlauf der Apoptose treten Ereignisse in chronologischer Reihenfolge auf, eins nach dem anderen, was zur Bildung apoptotischer Vesikel führt, und dann tritt Apoptose ein. Apoptose spielt eine entscheidende Rolle bei der Embryonalentwicklung und Morphogenese, der Aufrechterhaltung einer stabilen Population normaler Zellen in Geweben, der Abwehr und Immunreaktion des Körpers, bei Zellschäden durch Krankheiten oder Vergiftungen, beim Altern und bei der Entwicklung von Tumoren und hat einen potenziellen therapeutischen Wert.
Detektionsprinzip
Die Verteilung von Phospholipiden in normalen Zellmembranen ist asymmetrisch. Phosphatidylserin (PS) befindet sich auf der Innenseite der Zellmembran in lebenden Zellen. Während der Apoptose verändert sich die Zellmembran, und PS wird von der Innenseite der Zellmembran auf die Außenseite der Zellmembran geschoben. Annexin V erkennt spezifisch PS auf der Oberfläche apoptotischer Zellen, während sich PS aus lebenden Zellen auf der Innenseite der Zellmembran befindet und nicht spezifisch an Annexin V binden kann.
Die PS nekrotischer Zellen kippt ebenfalls von der inneren Oberfläche der Zellmembran zur äußeren Oberfläche der Zellmembran, und Annexin V erkennt auch die PS auf der Oberfläche nekrotischer Zellen, sodass Annexin V nicht zwischen nekrotischen und apoptotischen Zellen unterscheiden kann. Im Gegensatz dazu konnte sich der PI-Farbstoff an intrazelluläre DNA binden und zwischen nekrotischen Zellen und lebenden Zellen unterscheiden. Die Zellmembran von frühen apoptotischen Zellen und lebenden Zellen ist noch intakt, und der PI-Farbstoff kann die Zellmembran nicht frei passieren, um in die Zelle einzudringen und sich an die DNA zu binden, sodass der PI-Farbstoff apoptotische Zellen und lebende Zellen nicht markieren kann, während der PI-Farbstoff die Zellmembran der nekrotischen Zellen passieren und sich an die DNA im Inneren der Zelle binden kann, und der PI-Farbstoff in den nekrotischen Zellen wird nach Anregung durch den 488-nm-Laser eine rote Fluoreszenz emittieren, die vom entsprechenden Kanal empfangen wird. Daher können Annexin V und PI gleichzeitig verwendet werden, um zwischen lebenden Zellen, früh apoptotischen Zellen und spät apoptotischen oder nekrotischen Zellen zu unterscheiden.
Abb. 2 Prinzip der Annexin V / PI-Erkennung
Durchflusszytometrie-Erkennung
Die maximale Anregungswellenlänge von FITC beträgt 488 nm, die maximale Emissionswellenlänge beträgt 525 nm und die grüne Fluoreszenz von FITC wird im FL1-Kanal erkannt. Die maximale Anregungswellenlänge des PI-DNA-Komplexes beträgt 535 nm, die maximale Emissionswellenlänge 615 nm und die rote Fluoreszenz von PI wird im FL2- oder FL3-Kanal erkannt. Die Analyse wurde mit Software wie CellQuest durchgeführt und ein zweifarbiges Streudiagramm mit FITC als horizontaler Koordinate und PI als vertikaler Koordinate erstellt. In typischen Experimenten können die Zellen in drei Subpopulationen unterteilt werden, wobei lebende Zellen nur eine sehr schwache Hintergrundfluoreszenz aufweisen, früh apoptotische Zellen nur eine starke grüne Fluoreszenz aufweisen und spät apoptotische Zellen eine doppelte Färbung mit grüner und roter Fluoreszenz aufweisen.
Abb. 3 Durchflusszytometrie-Erkennung
Häufig gestellte Fragen
F: Kann der Annexin V-Apoptosetest auf Pflanzen oder Bakterien (Prokaryoten) angewendet werden?
A: Ja, aber es ist notwendig, Protoplasten vorzubereiten, da Pflanzenzellen oder Bakterien (Prokaryonten) Zellwände enthalten. Die spezifische Dosierung der Färbelösung muss nur die Zellen eintauchen, und die Färbezeit ist für verschiedene Zellen etwas unterschiedlich.
F: Wie ist das Ergebnis des Experiments zu beurteilen?
A: Lebende Zellen (Annexin V-/PI-), früh apoptotische Zellen (Annexin V+/PI-), spät apoptotische Zellen und nekrotische Zellen zeigen doppelte Positivität (Annexin V+/PI+), nackte Kerne (Annexin V-/PI+).
F: Was ist der Unterschied zwischen Annexin V und TUNEL?
A: Die Nick-End-Markierung der terminalen Desoxynukleotidyltransferase dUTP (TUNEL) ist eine Färbemethode zur Identifizierung intrazellulärer DNA-Fragmentierungsstellen – ein charakteristisches Merkmal der späten Apoptose.
Durch Annexin-V-Färbung werden die frühen Stadien der Apoptose erkannt, indem an PS-Reste gebunden wird, die aufgrund des Verlusts der Zellmembranasymmetrie außerhalb der Zelle freiliegen.
F: Ist es möglich, den Test nur mit Annexin V-FITC durchzuführen, ohne PI zu erkennen?
A: Ja, das ist möglich. Bei speziellen Testproben, wie z. B. roten Blutkörperchen ohne Kerne, oder bei Verwendung des Medikaments Doxorubicin (Adriamycin), das die PI-Erkennung beeinträchtigt, ist es in beiden Fällen möglich, den Test nur mit Annexin V-FITC durchzuführen.
Produktdetails
| Produktname | Artikelnr. | Spezifikation |
| Annexin V-FITC/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-PE/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD Apoptose-Erkennungskit | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |