Schlüsselenzyme, die an der NGS -Bibliothekskonstruktion beteiligt sind

Abbildung 1. Sequenzierungsworkflow der nächsten Generation^[2]

1. Aufbau einer DNA-Bibliothek und ihre Schlüsselenzyme
2. Aufbau einer RNA-Bibliothek und ihre Schlüsselenzyme
3. Leitfaden für NGS-Kernenzyme beim Aufbau von DNA- und RNA-Bibliotheken

1. Aufbau einer DNA-Bibliothek und ihre Schlüsselenzyme

Beim Aufbau einer DNA-Bibliothek ist der Aufbau einer TA-Klonligationsadapter-Bibliothek derzeit das am häufigsten verwendete technologische Mittel. Der Hauptprozess des Bibliotheksaufbaus ist wie folgt:

Abbildung 2. Prozess der DNA-Bibliothekskonstruktion (Illumina)

1.1 DNA-Fragmentierung

Die aktuellen Sequenzierer haben typischerweise eine Sequenzierungslänge im Bereich von 150-500 Basenpaaren (bp). Daher ist es notwendig, mechanische oder enzymatische Fragmentierungsmethoden anzuwenden, um große genomische DNA-Fragmente in kleinere zu zerlegen. Mechanische Fragmentierung kann zu relativ hohen Probenverlusten führen und ist mit einem komplizierteren Arbeitsablauf verbunden. Andererseits ist die enzymatische Verdauung eine häufig verwendete Methode zur Fragmentierung genomischer DNA. Im Vergleich zu mechanischen Methoden ist die enzymatische Verdauung kostengünstiger und unkomplizierter, da die Reaktion nach Zugabe des Fragmentierungsenzyms nur eine festgelegte Zeitspanne benötigt.

Derzeit werden hauptsächlich zwei Arten von Fragmenten verwendet. Eines basiert auf der Tn5-Transposase, die auf Transposonprinzipien basiert, während das andere eine Mischung aus Endonukleasen verwendet. Die Wirksamkeit dieser Fragmente kann jedoch durch den GC-Gehalt und die Basenpräferenzen der DNA beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu bieten die von Yeasen (Cat#12917) entwickelten Fragmente einen stabilen Verdauungseffekt und weisen im Vergleich zur Tn5-Transposase eine deutlich geringere Stellenpräferenz auf. Sie liefern durchweg hervorragende Sequenzierungsergebnisse für verschiedene Arten von DNA-Proben, einschließlich solcher aus FFPE-Proben.

1.2 Endreparatur, dA-Tailing

Die fragmentierte DNA erzeugt 5'/3'-Klebeenden und DNA mit stumpfen Enden. Alle Klebeenden müssen in stumpfe Enden umgewandelt werden, einschließlich der Entfernung von 3'-Überhängen und dem Auffüllen von 5'-überstehenden DNA-Enden. Wenn TA-Ligation für die Adapterligation verwendet wird, muss das DNA-Fragment auch am 5'-Ende phosphoryliert werden und am 3'-Ende muss ein „A“ hinzugefügt werden, um komplementär zum Adapter mit dem „T“-Klebeende zu sein.Der obige Prozess wird durch die Zusammenarbeit von T4-DNA-Polymerase, T4-Polynukleotidkinase und Taq DNA-Polymerase.
T4 DNA-Polymerase (Kat.-Nr. 12901) hat 5'→3' DNA-Polymerase-Aktivität, die die Synthese von DNA entlang der 5'→3'-Richtung katalysieren und das 5'-überstehende Ende auffüllen kann. Gleichzeitig hat das Enzym auch 3'→5' Exonuklease-Aktivität, um 3'-überhängende Enden abzuspalten und so DNA-Fragmente mit klebrigen Enden in DNA mit stumpfen Enden umzuwandeln.
Da die 5'-Enden synthetischer PCR-Primer und -Adapter normalerweise Hydroxylgruppen statt Phosphatgruppen sind, wird T4-Polynukleotidkinase (Kat.-Nr. 12902) benötigt, um die Übertragung von ATP-γ-Phosphatgruppen auf das 5'-Hydroxylende der Oligonukleotidkette in Gegenwart von ATP zu katalysieren und so den nächsten Schritt der Adapterligation vorzubereiten.
S-Taq DNA-Polymerase (Kat.-Nr. 13486) hat eine 5'→3'-Polymeraseaktivität, die DNA aus der 5'→3'-Richtung synthetisieren kann. Gleichzeitig hat es eine Desoxynucleotidyltransferaseaktivität, die ein Nukleotid „A“ an das 3'-Ende des PCR-Produkts anfügen kann.

Abbildung 3. Mehrere Enzyme sind am Endreparaturprozess beteiligt

Abbildung 4. S-taq fügt mit sehr hoher Effizienz A an die vier Basen von ATCG am 3'-Ende der durch Kapillarelektrophorese nachgewiesenen Gensegmente an.

1.3 Adapterligatur

Adapter stellen eine entscheidende Komponente der Bibliothek dar. Im Bereich der Illumina-Sequenzierung umfassen die häufig verwendeten Y-Typ-Adapter die Sequenzen P5/P7, Index und Rd1/Rd2 SP. Unter diesen dient die Sequenz P5/P7 dazu, sich mit der auf dem Sequenzierungschip vorhandenen Sequenz zu paaren und so die zu analysierenden Fragmente auf der Durchflusszelle zu verankern, um eine Brückenamplifikation durchzuführen. Die Indexsequenz wird verwendet, um zwischen verschiedenen Proben innerhalb der gemischten Bibliothek zu unterscheiden, die einer Sequenzierung unterzogen wird, während Rd1/Rd2 SP die Regionen zum Binden der Sequenzierungsprimer Read1 und Read2 bezeichnen.

Für die Aufgabe der Adapterligatur T4 DNA-Ligase (Kat.-Nr. 12996) ist die Standardauswahl. Es weist die Fähigkeit auf, einzelsträngige Bruchstellen in doppelsträngiger DNA zu reparieren und benachbarte Nukleotide wieder zu verbinden.

Abbildung 5. Allgemeiner Adapterligaturprozess (Illumina)

Abbildung 6. Überprüfung von T4-DNA-Ligase-Mutanten durch Ligation von 170-bp-DNA mit 80-bp-Adaptern.

1.4 PCR-Amplifikation

Erhalten Sie mithilfe von Adaptern durch eine PCR-Reaktion genügend DNA-Sequenzen und schließen Sie die Sequenzierung der Nukleinsäuresequenz der Probe auf dem Gerät ab. Hieff Canace^TM Die häufig bei der PCR verwendete Pro High-Fidelity DNA-Polymerase (Kat.-Nr. 13476) hat eine 5'→3'-Polymeraseaktivität und kann DNA in 5'→3'-Richtung synthetisieren. Darüber hinaus besitzt sie auch die Aktivität einer 3'→5'-Exonuklease, die den falschen Einbau von Basen während des Amplifikationsprozesses korrigieren kann, um DNA-Fragmente schnell und mit hoher Genauigkeit zu amplifizieren.

2. Aufbau einer RNA-Bibliothek und ihre Schlüsselenzyme

Je nach RNA-Typ kann der Aufbau einer RNA-Bibliothek in mRNA-Bibliothek, LncRNA-Bibliothek usw. unterteilt werden. Die herkömmliche RNA-Bibliothek umfasst die folgenden Prozesse:

Abbildung 7. Prozess der mRNA-Bibliothekskonstruktion (Illumina)

2.1 RNA-Anreicherung

Ob bei Eukaryoten oder Prokaryoten, ribosomale RNA (rRNA) ist die am häufigsten vorkommende RNA und macht bis zu 80 % des gesamten RNA-Gehalts aus. Bei der direkten Sequenzierung der gesamten RNA einer Probe wird ein erheblicher Teil der Sequenzierungsdaten mit rRNA in Zusammenhang stehen. Um diese Interferenz zu mildern, muss die Methode der RNA-Anreicherung eingesetzt werden. Dafür gibt es zwei Hauptmethoden: mRNA-Anreicherung basierend auf Oligo-dT und rRNA-Depletionsmethoden.

Bei Eukaryoten weist mRNA am 3'-Ende eine ausgeprägte Poly(A)-Struktur auf. Oligo-dT-Perlen können verwendet werden, um die gesamte aus der Probe transkribierte mRNA zu erfassen, was sie für die Transkriptionsanalyse geeignet macht, insbesondere bei hochwertigen RNA-Proben. rRNA-Depletionsmethoden hingegen stellen geringere Anforderungen an die Probenqualität und können sowohl auf Proben geringer Qualität (z. B. FFPE-Proben) als auch auf RNA-Proben hoher Qualität sowie auf prokaryotische Proben angewendet werden. Der häufig verwendete kommerzielle Ansatz beinhaltet die Verwendung von RNase H-Verdauung zur Entfernung von rRNA, wobei diese spezifischen Schritte befolgt werden:

1. Synthetisieren Sie spezifische Oligonukleotidsonden, die für die Bindung an rRNA entwickelt wurden.
2. Verwenden Sie RNase H (Kat.-Nr. 12906), die RNA im RNA-DNA-Hybridstrang abbauen kann, um die an die Sonden gebundene rRNA selektiv zu entfernen.
3. Zum Schluss verdauen Sie die DNA-Sonden mit DNase I (Kat.-Nr. 10325), das sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA abbauen kann und rRNA effektiv eliminiert. Weitere Informationen zu DNase I finden Sie unter diesem Link.

Abbildung 8: Schematische Darstellung der enzymatischen rRNA-Depletion^[5]

2.2 RNA-Fragmentierung

Normalerweise werden große RNA-Fragmente unter der Einwirkung zweiwertiger Metallkationen und hoher Temperaturen in kleine Fragmente zerlegt.

2.3 Synthese des 1. Strangs der cDNA

Reverse Transkription der erhaltenen Ziel-RNA in den ersten Strang der cDNA. Da RNA leicht durch in der Umwelt vorhandene RNasen abgebaut wird, ist die Verwendung von RNase-Inhibitor (Kat.-Nr. 14672) während der reversen Transkription kann die Aktivität dieser Enzyme hemmen und RNA vor RNase-Abbau schützen. Gleichzeitig Reverse Transkriptase (Kat.-Nr. 11112) wurde verwendet, um die Matrizen-RNA in cDNA umzuwandeln. Die Reverse Transkriptase hat eine RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität und kann RNA als Matrizen verwenden, um eine cDNA in 5'→3'-Richtung zu synthetisieren. Der DNA-Einzelstrang ist komplementär zur RNA-Matrize.

Während des 1. Die Einbeziehung von Actinomycin D hat bei der Synthese von Strang-cDNA die Konstruktion strangspezifischer Bibliotheken unbestreitbar verbessert und die Kettenspezifität deutlich erhöht. Diese Innovation hat den experimentellen Prozess rationalisiert und ihn für Forscher vereinfacht.

Actinomycin D hat jedoch auch seine Nachteile: Es ist toxisch und muss vor Licht geschützt werden. Angesichts der steigenden Nachfrage nach vorgefertigten Kits und Kits zum Aufbau von Plattenbibliotheken stellt die Notwendigkeit des Lichtschutzes eine Einschränkung für die Weiterentwicklung von Plattenkits dar.

Glücklicherweise hat die Yeasen ZymeEditor-Plattform einen bahnbrechenden MMLV-Enzymmutanten (Inquiry) eingeführt, der die Funktion von Actinomycin D ersetzt. Ein neuer Kit (Kat.: 12340ES) wurde mit geruchlosen, ungiftigen und no müssen vermeiden Licht. Es bietet eine überlegene Kettenspezifität und beseitigt Bedenken in Bezug auf Gesundheit und Lichtempfindlichkeit.

Abbildung 9: Engineering von MMLV zur Identifizierung von MMLV-Mutanten, die zur Standard-RNA-Sequenzierung beitragen könnten

2.4 Synthese des zweiten cDNA-Strangs

Die durch Reverse Transkription produzierte einzelsträngige cDNA ist höchst instabil, was die sofortige Synthese des zweiten cDNA-Strangs unter dem Einfluss der DNA-Polymerase I erforderlich macht. Während dieser Zweitstrangsynthese kommt RNase H ins Spiel, indem sie den RNA-Strang aus der RNA-DNA-Hybridstruktur entfernt. Sie arbeitet zusammen mit DNA-Polymerase I (Kat.-Nr. 12903) um die katalytische Synthese des komplementären zweiten Strangs der cDNA zu erleichtern. DNA-Polymerase I besitzt 5'→3'-DNA-Polymeraseaktivität und synthetisiert, geleitet von einer Vorlage und einem Primer, eine Sequenz, die die einzelsträngige cDNA in der 5'→3'-Richtung ergänzt.

Die nachfolgenden Schritte im Prozess umfassen Endreparatur, dA-Tailing, Adapterligation und PCR-Amplifikation, die alle im Verfahren zur DNA-Bibliothekserstellung ausführlich beschrieben sind und hier nicht wiederholt werden müssen. Es ist erwähnenswert, dass nach Abschluss der Reverse-Transkription keine weitere Fragmentierung des Nukleinsäurefragments erforderlich ist.

3. Leitfaden für NGS-Kernenzyme beim Aufbau von DNA- und RNA-Bibliotheken

Yeasen ist ein Biotechnologieunternehmen, das sich mit der Forschung, Entwicklung, Produktion und dem Vertrieb von drei wichtigen biologischen Reagenzien beschäftigt: Moleküle, Proteine ​​und Zellen. Das Unternehmen Yeasen Biotech stellt eine Vielzahl von Enzymen her, die für den Aufbau von NGS-Bibliotheken relevant sind. Sie können aus der folgenden Tabelle das am besten geeignete Produkt zum Aufbau von Bibliotheken auswählen.

Tabelle 1.Leitfaden für NGS-Kernenzyme beim Aufbau von DNA- und RNA-Bibliotheken

Tabelle 2.DNA- und RNA-Bibliothek Vorbereitungskit

	Name	Katze#	Hinweise
DNA	Hieff NGS DNA-Bibliotheksvorbereitungskit	13577ES	Tumor/ Mechanische Methode
	Hieff NGS OnePot Pro DNA-Bibliotheksvorbereitungskit V2	12194ES	Tumor/ Enzymatische Methode
	Hieff NGS OnePot II DNA Library Prep Kit für Illumina	13490ES	Pathogen/ Enzymetisch/ normale Zeit (140min)
	Hieff NGS OnePot Flash DNA-Bibliotheksvorbereitungskit	12316ES	Pathogen/ Enzymatisch/ Ultraschnell (100 Minuten)
	Hieff NGS DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2	12305ES	Pathogen/ Enzyme/ DNA & RNA Co-Prep
RNA	Hieff NGS Ultima Dual-Mode mRNA-Bibliotheksvorbereitungskit	12308ES	Ohne Oligo dT Magnetkügelchen, 11 Röhrchen
	Hieff NGS Ultima Dual-Mode mRNA-Bibliotheksvorbereitungskit	12309ES	Oligo dT Magnetperlen plus, 14 Röhrchen
	Hieff NGS® Ultima Dual-Mode RNA-Bibliotheksvorbereitungskit	12310ES	Vorgemischte Version, 5 Tuben
	Hieff NGS ® EvoMax RNA Library Prep Kit (Vorgemischte Version) (Actinomycin D Frei)	12340ES	Vorgemischte Version, (Actinomycin D Frei)
	Hieff NGS® MaxUp rRNA-Depletion Kit (Pflanze)	12254ES	Anlage
	Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA und ITS/ETS)	12257ES	Menschlich

Verweise:

[1] Mardis, Elaine R. Sequenzierungsplattformen der nächsten Generation[J].
[2] Gulilat M, Lamb T, Teft WA, et al. Gezieltes Next-Generation-Sequencing als Instrument der Resektionsmedizin[J]. BMC Medical Genomics, 2019, 12(1):81.
[3] Lundberg KS, Dan DS, Adams M, et al. Hochpräzise Amplifikation mithilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase, isoliert aus Pyrococcus furiosus[J]. Gene, 1991, 108(1):1-6.
[4] Miyazaki K. Zufällige DNA-Fragmentierung mit Endonuklease V: Anwendung für das DNA-Shuffling[J]. Nucleic Acids Research, 2002, 30(24):e139.
[5] Baldwin A, Morris AR, Mukherjee N. Eine einfache, kostengünstige und skalierbare Methode zur Depletion menschlicher ribosomaler RNA für RNA-seq[J]. Current Protocols, 2021, 1(6):e176.